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SARS冠狀病毒之附屬蛋白質ORF8a和ORF8之特性

為了解決果子貍英文的問題，作者黃俞淵 這樣論述：

SARS-CoV是一種引起嚴重急性呼吸道症候群 (severe acute respiratory syndrome, SARS)的冠狀病毒。由人類檢體所分離出的SARS-CoV可能來自於果子狸或貉。比較從果子貍分離出的動物SARS-CoV-like virus和人類的SARS-CoV的基因序列，有99.8%的相似度。主要的序列差異在於人類的ORF8有29個核苷酸的減少。動物的SARS-CoV-like virus在宿主細胞內會轉譯一條連續性的ORF8蛋白質，而人類的SARS-CoV則在宿主細胞內轉譯出兩條蛋白質ORF8a及ORF8b。在本實驗室之前的研究顯示，ORF8a位於粒線體。在酵母菌

雙雜合系統，發現ORF8a和細胞內的調控鈣離子濃度的蛋白質CAML有交互作用，但ORF8及ORF8b並沒有。在Hela細胞的Tet/on系統中，發現ORF8a會增強staurosporine所引起的細胞凋亡。而本論文的主要目標在於研究ORF8a及ORF8其特性及生物功能，藉此更進一步了解病毒在宿主細胞的致病機轉。 利用細胞螢光呈色及次細胞分離法，我們發現當細胞內CAML正常存在時，ORF8a主要位於粒線體，而ORF8可能位於內質網。若我們過度表現CAML在細胞內，ORF8a和ORF8會改變原來的表現位置，和CAML的分布有很明顯的共位現象。利用免疫沉澱法，證實這個現象可能是因為ORF8a

或ORF8和CAML皆有交互作用。ORF8a和CAML有很強的交互作用，但ORF8和CAML則有較弱的結合能力，導致ORF8a改變原來的分布。在之前的研究發現，SARS-CoV同樣會感染肺部及腸道細胞，並可以進行複製，但肺部細胞有嚴重的細胞凋亡，腸道細胞卻沒有。我們分別利用肺部細胞株A549以及結腸細胞株Caco-2，表現ORF8a或ORF8以觀察是否會造成細胞凋亡。我們在A549表現ORF8a及ORF8，並利用Propidium iodide染色，發現有DNA斷裂的情形；利用TMRM染劑偵測粒線體膜電位變化，當A549處理Staurosporine，使細胞走向凋亡，發現ORF8a和ORF8皆

會促進此凋亡的反應；只處理DMSO的控制組，ORF8a和ORF8也有較低程度的細胞凋亡，和propidium iodide染色的實驗相呼應。有趣的是，腸道細胞株Caco-2無論有無處理Staurosporine，皆不會促進細胞凋亡。 目前，我們並不清楚ORF8a或ORF8是否藉由和CAML的交互作用，而影響細胞凋亡。未來我們將建立降低CAML表現的A549及Caco-2細胞，並重複上述的實驗，以觀察ORF8a或ORF8所造成細胞凋亡，和細胞內蛋白質CAML的關連。