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膜脂質成分對HIV-1 Vpr蛋白與膜之間交互作用的影響

為了解決production i.g 2021的問題，作者劉君浩 這樣論述：

Vpr蛋白在人類免疫缺乏病毒1的生命週期中扮演多重角色，例如，Vpr能夠協助預嵌入複合體（pre-integration complex）穿過核膜進入細胞核、反式激活長末端重複（long-terminal repeat）所調節的基因、誘發細胞凋亡以及引發細胞週期停滯於G2期，而這些角色使病毒對細胞的毒性及影響加劇。另外，研究指出Vpr能夠和膜脂質作用，例如，Vpr能在膜上形成陽離子選擇通道、促使膜的通透性增加，並且能有效的將DNA從膜外送入細胞。然而，我們並不清楚Vpr與膜作用的機制為何，以及此作用會受到哪些因素的影響。在過去，為了大量生產Vpr以研究其結構及特性，藉由大腸桿菌表達重組蛋白的

方式，因受到細菌停滯效應的影響，產量並不理想。因此在之前的蛋白質結構研究中，主要藉由化學合成的方式製造蛋白質，並因受限其溶解度，結構是在極端的有機溶劑中鑑定。在此研究中，我們設計了一個利用大腸桿菌表現His-tagged GB1-fused Vpr蛋白的新穎載體，顯著地提升了蛋白質的產量。藉由細菌在攝氏18度、自訂的培養基（defined growth medium）中所產出高達每升10毫克的蛋白質產量，使後續對Vpr的生物化學及生物物理性質的系統性鑑定更加容易。為了更深入了解Vpr與膜之間的作用，我們分析了Vpr在許多不同類膜構造中的整體二級結構，包括在脂疊（bicelle）、微脂體（lip

osome） 以及利用十二烷基膽鹼（dodecylphosphorylcholine）界面活性劑來形成的微胞（micelle）。另外，在鈣黃綠素釋出實驗與共組裝奈米圓盤實驗中，我們發現Vpr與膜之間的交互作用在含有1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)（DOPG）脂質的情況勝於只含有1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（DOPC）脂質。為了量化Vpr和膜之間的結合強度，我們更進一步的利用石墨烯場效電晶體（graphene based field effect transistor）生物感

測器，測得Vpr和含有DOPG的膜之間的解離常數為9.6 ± 2.1 μM。而Vpr與只有DOPC的膜之間的作用，無法量測到顯著的變化，證明Vpr與DOPC之間的作用相對微弱。在過去，Vpr促使細胞凋亡的現象被認為是來自於Vpr和電壓依賴性陰離子選擇性通道（voltage-dependent anion channel）之間的交互作用，為了更加了解他們的作用強度，我們利用上述生物感測器來定量。當人類電壓依賴性陰離子選擇性通道1（hVDAC-1）置於只含有DOPC脂質的膜時，我們量測到Vpr和hVDAC-1之間的解離常數為5.1 ± 0.9 μM，為其他鑑定提供了參考依據。在細胞膜中膽固醇是脂筏

的主要成分，在HIV-1的生命週期，特別是病毒組裝及出芽的過程中，扮演重要的角色。因此，我們希望進一步探討膽固醇對Vpr和膜之間的影響。首先，在鈣黃綠素釋放實驗中，發現膜的通透性會隨著膽固醇濃度增加而減少。另外，我們還使用了固態核磁共振來得知Vpr在蛋白微脂體（proteoliposome）中局部區域的化學環境。在交叉極化（cross polarization）魔術角旋轉（magic angle spinning）核磁共振的訊號中，我們發現碳13呈現出較寬的化學位移分布，表示Vpr在蛋白微脂體中感受到多樣的化學環境。在碳{磷}的旋轉回聲雙共振（rotational-echo double-re

sonance）實驗中，我們發現兩種不同退相特徵（dephasing feature）的共振訊號，分別對應於Vpr上的半胱胺酸跟脂質上的磷酸基之間不同的距離。儘管我們並沒有足夠證據顯示膽固醇會直接作用於Vpr，或是改變其結構，但是膽固醇的存在確實改變了Vpr在不同化學環境的分布，這顯示出Vpr跟膜之間的作用確實會受到膽固醇的調控。此篇研究顯示，對於Vpr和膜之間的作用，膜脂質的成分是一個重要的影響因素。我們相信，藉由更深入的了解Vpr的功能以及所扮演的角色，有助於對後天免疫缺乏症候群提供新的治療方法。