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台灣不同養殖魚類發光菌之基因型、分子型、致病性特徵與疫苗開發

為了解決pk鬥魚混養的問題，作者方孝仲 這樣論述：

魚類巴氏桿菌症(Pasteurellosis)又稱發光桿菌症(Photobacteriosis)，是由海水養殖魚類中危害最嚴重的細菌病原體發光桿菌 (Photobacterium damselae subsp. piscicida, Phdp)引起。自1963年美國首次從野生的白鱸（Morone americanus）和條紋鱸（M. saxatilis）發現以來，發光桿菌症已傳播到全球各地之不同魚種。在台灣，最早的文獻指出鱧魚（Channa maculata）感染病病症後，陸續在許多養殖魚類中，如海鱺（Rachycentron canadum）、蓋斑鬥魚（Macropodus opercul

aris）和疊波蓋刺魚（Pomacanthus semicirculatus；俗名：神仙魚）均有本病原感染病例被證實。然而台灣相關魚類細菌性病原研究中，截至目前為止，仍嫌少對於發光桿菌 (Phdp)基因性、分子性與致病性間相關流行病學探討其致病性，並進入研製對本病預防控制的有力工具〝疫苗〞的給予，期望對控制本病，減少水產養殖過程中化學藥品或抗生素的使用量與環境永續無汙染盡一份心力。首先，從台灣的不同罹病魚種來源收集39株發光桿菌 (Phdp)分離株，利用單管多引子聚合酶連鎖反應技術(multiplex PCR)確認菌種為Phdp。繼之，進行來自不同宿主和年份間各分離株之表現型(phenotyp

ic)和基因型(genotypic)特性及毒力基因(virulence genes)分布特性，並利用親源樹分析(phylogenetic analysis)和致病性測試。結果顯示，不同Phdp分離株間具有相同的表現型特性。但以限制酶SmaI和NotI進行脈衝式電泳（pulsed-field gel electrophoresis; PFGE）分析顯示染色體核酸片段(band patterns)均可分為2型。16S rDNA和Fur基因序列之親源分析顯示無法區辨至亞種，而ToxR基因則可區辨發光桿菌兩個亞種。偵測AIP56，P55，PDP_0080，Sod和Irp1等致病基因後發現，在所有分離株

中均具有這些基因。但是，分別以海鱺和尖吻鱸進行九株候選Phdp分離株之致病力研究顯示，分離株間的致病力確實存在差異。使用不同分離株測試死亡率相近的海鱺與尖吻鱸顯示，尖吻鱸在實驗室條件下對此種細菌有較明顯感受性，可在往後的研究中用做實驗模型。目前針對發光桿菌 (Phdp)疫苗開發中已記載有四種不同疫苗類型，如全細胞疫苗(Whole-cell vaccine)、減毒活疫苗(Live attenuated vaccine)、DNA疫苗(DNA vaccine)和次單位疫苗(Subunit vaccine)。其中又以重組次單位疫苗之製備成本低廉，安全性高，受污染機會少等優點，因此吾人就本菌 (Phdp

) 熱休克蛋白(Heat-shock proteins)之重組次單位疫苗，包括HSP90、HSP33、HSP70與DnaJ等高免疫原性之重組蛋白研製，並以尖吻鱸(Lates calcarifer)作為實驗動物模組，進行疫苗保護效力評估。Phdp四種候選重組疫苗(HSP90，HSP33，HSP70和DnaJ)以載體pET-151轉殖入大腸桿菌BL21（DE3）中進行蛋白質表現並純化，以30:70（v / v）的比例混合佐劑Montanide ISA 763 AVG，腹腔注射50尾尖吻鱸，對照組2組(各別注射PBS及佐劑ISA)。當魚體進行標的疫苗免疫後、確實可產生高抗體力價、血清溶菌酶活性(se

rum lysozyme activities) 以及殺菌作用；並可偵測出抗原蛋白（特別是rHSP33）。此外，接種疫苗後，免疫組魚隻淋巴器官的早期免疫反應中亦可偵測到相關免疫基因的高表現量。當以Phdp菌(編號AOD105021)進行各組疫苗(HSP90，HSP33，HSP70和DnaJ)之保護效力評比攻毒，各組之相對存活率分別為48.28％，62.07％，51.72％和31.03％。綜合上述「魚類發光桿菌疫苗」研發結果顯示，HSP33確實為優秀候選疫苗抗原。