工業和商業黃頁資訊網論文書籍站
國立陽明大學 生物化學研究所 吳妍華所指導 高智飛的 C型肝炎病毒核心蛋白與細胞轉錄因子之交互作用 （2003），提出WMF SOGO關鍵因素是什麼，來自於C型肝炎病毒、核心蛋白、轉錄因子、p53。
C型肝炎病毒核心蛋白與細胞轉錄因子之交互作用
為了解決WMF SOGO 的問題，作者高智飛 這樣論述：
C型肝炎病毒核心蛋白（core protein）除了是構成包裹病毒基因體的主要結構蛋白，藉由與不同細胞因子之交互作用，使其具有影響及調控宿主細胞正常功能的特質，在本論文中，主要的方向是探究C型肝炎病毒核心蛋白是否會干擾正常細胞的三種RNA 聚合酶所調控的轉錄機制。 過去已經有許多研究發現，C型肝炎病毒核心蛋白能夠藉由與多種具啟動子專一性細胞轉錄因子的結合作用，影響許多由RNA聚合酶 II（RNA Pol II）所轉錄之基因啟動子活性（其中包括宿主細胞及病毒基因），而這些受到影響的基因表現，被推測可能是導致C型肝炎的致病機轉。在本論文中，我們第一次發現在七種C型肝炎病毒蛋白
中，只有核心蛋白可以活化由RNA聚合酶 I（RNA Pol I）所主導之轉錄，這個活化作用至少需要核心蛋白N端156胺基酸片段；此外，藉由觀察核心蛋白point mutation的轉活能力，我們發現核心蛋白Ser116 和Arg117胺基酸的完整性，對於其調控ribosomal RNA (rRNA) transcription有決定性的影響。為了進一步了解由C型肝炎病毒核心蛋白所引起的轉活機制，我們利用DNA親合層析將座落於rRNA啟動子上的RNA Pol I複合體純化分離，發現核心蛋白會增加upstream binding factor（UBF）及RNA聚合酶I與rRNA啟動子的親合力，進而
活化RNA Pol I transcription，同時，我們也發現這種活化現象伴隨著細胞內UBF Ser residue的高度磷酸化，另一個重要的發現是C型肝炎病毒核心蛋白也會座落在這包含RNA聚合酶的複合體內。藉由分析核心蛋白與RNA Pol I轉錄因子間的交互作用，我們了解核心蛋白可藉由與TATA 結合蛋白（TBP）的直接交互作用，和selectivity factor 1（SL1）在細胞內形成複合體，進而參與調控RNA Pol I transcription。 除了對於rRNA transcription的調控，利用in vivo報導基因分析，我們發現核心蛋白對於R
NA Pol III-dependent的轉錄也有活化作用，隨著核心蛋白的表現增加，活化的效果就越明顯，而且這活化的能力也至少需要核心蛋白N端156胺基酸片段；此外，核心蛋白並且可與TBP協同活化RNA Pol III transcription。先前的研究已知腫瘤細胞的生長需要大量且快速的RNA Pol I及RNA Pol III transcription，C型肝炎病毒核心蛋白轉活這兩種轉錄活性的特點，可能參與C型肝炎所引發hepatocarcinogenesis的過程。 至於C型肝炎病毒核心蛋白對於基礎啟動子的影響，利用in vitro run-off 轉錄實驗及in
vivo報導基因分析，我們發現核心蛋白本身對於由RNA Pol II所主導的heat shock protein 70（hsp70）基礎啟動子有活化作用，隨著核心蛋白的表現增加，活化的效果就越明顯，相對於其他種類的病毒蛋白，這個現象非常特別；此外，我們也發現C型肝炎病毒核心蛋白N端156胺基酸片段就具有此活化能力，核心蛋白並可與TBP協同活化此基礎啟動子，顯示兩個蛋白間有著功能性的直接關聯。我們利用共同免疫沉澱分析，發現C型肝炎病毒核心蛋白可與細胞基礎轉錄因子TATA 結合蛋白（TBP）及RNA 聚合酶 II最大次單元（RNA Pol II largest subunit: hRPB1）可在
細胞內形成複合體。另外，我們並沒有發現C型肝炎病毒核心蛋白與其他一般轉錄因子TFIIB，THIIH p44 subunit，TATA-associated factor II 250（TAFII250）有交互作用。核心蛋白與TBP 之結合作用區域落在核心蛋白N端 1-50胺基酸及TBP C端218-268胺基酸，且兩者間之作用皆不需要任何細胞內的修飾反應。若以electrophoretic mobility shift assay（EMSA）分析是否核心蛋白可影響TBP與TATA box的結合，實驗結果發現雖然C型肝炎核心蛋白並不會直接影響TBP-TATA結合，但另一方面，卻可促進包含有TBP
的複合體在TATA element進行結合作用，此外蔗糖梯度層析及共同免疫沉澱分析也發現核心蛋白與TBP及RNA 聚合酶 II最大次單元可在細胞核內形成分子量大於700 kDa的複合體。綜合以上的結果顯示，我們發現C型肝炎核心蛋白可以直接影響基礎啟動子活性，進而暗示核心蛋白具有能力去統合具啟動子專一性細胞轉錄因子和基礎轉錄因子的訊號傳送，影響不同基因的表現。 本實驗室先前已發現C型肝炎核心蛋白可與抑癌因子p53有結合交互作用，並可調控p53-mediated轉錄活化反應，當低濃度的核心蛋白存在細胞時，可與p53協同活化p53-dependent轉錄反應，而較高濃度的核心蛋白
存在細胞時，則會抑制p53的作用，顯示C型肝炎核心蛋白在不同的濃度下，對於p53的功能會有不同的調控。本論文的第二部分，接續之前的研究，首先進一步利用in vitro 結合實驗及in vivo共同免疫沉澱分析證實p53 C端75個胺基酸的完整，對於核心蛋白與p53的結合作用非常重要；而不論細胞內核心蛋白的濃度高低，利用EMSA實驗，發現p53的DNA結合作用都會被C型肝炎核心蛋白所增強，而此增強的p53 DNA結合作用，並不是因為細胞內p53的表現或是位址改變；另外一方面，我們發現不管細胞內核心蛋白的濃度為何，p53 C端Lys373和Lys382的乙醯化程度都有顯著的增加，而乙醯化的p53已
被證實有較佳的DNA結合活性，與我們所觀察到的現象符合；此外，p53 C端Lys373，Lys382的乙醯化是由p300/CREB-binding protein（CBP）的acetyltransferase活性所調控，而研究也發現p300/CBP的acetyltransferase活性對於其活化特定基因表現相當重要，利用in vitro 結合實驗及共同免疫沉澱分析，我們發現C型肝炎核心蛋白可與p300有結合作用，在細胞核內形成大型的複合體，根據這樣的發現，我們假設核心蛋白可能會干擾p300對於p53的乙醯化反應，進而影響p53的功能，但這個假設需要更進一步的證實。除了乙醯化的調控外，p53也
受到磷酸化的調控，實驗結果發現，p53上Ser15的磷酸化作用會受到不同濃度核心蛋白的調控，當低濃度的核心蛋白微量增強p53上Ser15 的磷酸化作用，高濃度的核心蛋白則有抑制的作用，這樣不同的磷酸化調控會導致不同的p53轉錄活化特性。 利用DNA-Protein複合體沉澱分離核心蛋白轉染之HepG2細胞內p53-DNA複合體，發現C型肝炎核心蛋白並沒有出現在包含有p53-DNA的蛋白複合體內，顯示核心蛋白與p53-DNA複合體的結合能力較弱，或是核心蛋白調控p53的反應發生在其與特化的DNA序列結合之前。研究指出p53對於RNA Pol I-與RNA Pol III-de
pendent的轉錄有抑制的作用，這種的活性對於p53管制細胞生長及複製相當重要，若同時轉染p53，核心蛋白表現質體和報導基因進入細胞內，我們發現C型肝炎核心蛋白可以解除p53對於RNA Pol I-與RNA Pol III-dependent的轉錄抑制作用，進而活化報導基因的表現。綜合以上的發現，在核心蛋白與p53的交互作用中，在不同的濃度下，C型肝炎核心蛋白對於p53的蛋白修飾及轉錄活化作用，有差別性的調控，而這種方式的調節控制，意謂著核心蛋白在C型肝炎相關的致癌進程，可能扮演多種不同的功能。