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輔仁大學 生命科學系碩士班 李永安所指導 蔡瑋倫的 十字花科黑腐病菌及葉斑病菌之簡易鑑別方法的機制研究 （2017），提出ISTA 6A關鍵因素是什麼，來自於十字花科黑腐病菌、葉斑病菌、十字花科細菌鑑別方法。
十字花科黑腐病菌及葉斑病菌之簡易鑑別方法的機制研究
為了解決ISTA 6A 的問題，作者蔡瑋倫 這樣論述：
十字花科作物的黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris; XCC)及葉斑病菌(X. campestris pv. raphani; XCR)，兩種病原細菌均經由種子傳播，因此在種子檢查時，如何區分XCC及XCR為重要的檢測項目。先前實驗室發現XCC和XCR均具有水解X-gal能力，此能力不受葡萄糖抑制，但XCC水解X-gal的能力會受NaCl抑制，XCR則不會，進而研發出SYG-Na-X (含Na+)培養基，在此培養基上XCC呈黃色，XCR因能水解X-gal而呈藍綠色，可以目視直接區分XCC及XCR。本研究將進一步了解XCC及XCR菌株負責水解X-
gal的基因為何，以及glucose和Na+影響該基因表現的可能機制。以Omegon-KmR (O-KmR)對XCC1-1及XCRE1兩菌株進行突變，分析突變株水解X-gal的能力及其受突變的基因，另選殖出XCC中註記為beta-galactosidase (gal)基因，測試其水解X-gal能力，並構築XCC菌株的gal基因剔除(knockout)突變株，以進行測試。實驗結果發現XCC1-1及XCRE1菌株在SYG-X (不含Na+)或SYG-Na-X培養基中，主要水解X-gal的基因為galC，因為XCC1-1及XCRE1突變株，galC的上游基因經O-KmR突變後，菌株在SYG-X及SY
G-Na-X培養基，均失去水解X-gal能力，galC與其上游基因可能形成operon，共用同一個promoter，當galC上游基因受O-KmR插入突變後，轉錄(transcription)會終止，致使galC無法表現，並且自XCC1-1及XCRE1菌株選殖出的galC，送入E. coli DH5，可表現出beta-galactosidase的活性，另外XCC1-1 galC-knockout突變株，在SYG-X培養基上，無法水解X-gal。分析另一株XCC1-1 O-KmR突變株B1，顯示galC基因的表現，可能受clp (CAP-like protein)的正向調控(positive
control)，因clp基因經O-KmR突變後，XCC1-1在SYG-X培養基中的水解X-gal能力會下降。另一XCC1-1 O-KmR突變株C1，在SYG-Na-X亦有水解X-gal的能力，O-KmR插入在petA (ubiquinol-cytochrome c reductase iron-sulfur subunit)基因，該基因突變，可能影響細菌細胞膜上的電子傳遞，導致Na+較不易進入細胞，故XCC1-1 C1菌株水解X-gal能力較不受Na+抑制。自XCC1-1及XCRE1選殖出的galD，雖可在E. coli DH5表現出beta-galactosidase活性，但並不參與在S
YG-X培養基中水解X-gal。本實驗亦開發出SYG-X試紙，XCC或XCR在此試紙上會生成深藍色小點，且從藍色小點內可分離出活的病原細菌，再以SYG-Na-X培養基區分XCC或XCR。