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敗血症大白鼠心臟功能衰竭時蛋白激A、C、和M角色之探討

為了解決Golf 7.5 Variant的問題，作者楊秀蘭 這樣論述：

中文總摘要 敗血症(sepsis)及其嚴重的併發症-敗血性休克(septic shock)，一直是臨床上高死亡率且又未能有效救治的困擾問題。在臨床上敗血症病人會先出現早期高血液動力狀態而晚期變成低血液動力狀態的雙向性變化現象。在敗血症晚期演變成多重器官功能衰竭的病人中，約有10~20 %的患者直接導致心臟功能衰竭。心臟的幫浦功能可由神經性及血循環中的兒茶酚胺類(catecholamines)作用於心肌細胞膜上的a-與b-腎上腺素性接受器後，產生二級傳訊者cAMP與Ca2+，再活化蛋白激A (PKA, cAMP-依賴型蛋白激)，蛋白激C (PKC, Ca2+/phos

pholipid-依賴型蛋白激) 以及蛋白激M (PKM; Ca2+/calmodulin-依賴型蛋白激; CaM kinase II) 將訊息傳遞下去。蛋白激A、C和M 在心臟功能運作時的生理角色是經由磷酸化各種酵素/接受器蛋白系統以維持心肌細胞Ca2+分佈的恒定而調控心跳速率(chronotropic效應)，心肌收縮力(inotropic效應)與心肌的舒張速率(lucitropic 效應)。此酵素/接受器系統包括b-與a-腎上腺素性接受器(b- and a-adrenergic receptor)、鈉-鉀腺三磷酸(Na+/K+-ATPase)、鈉鈣離子交換器(Na+/Ca2+

exchanger)、鈣離子腺三磷酸(Ca2+-ATPase)、 L-型鈣離子通道(L-type Ca2+ channel)、SERCA 2 (肌漿網膜上的Ca2+-ATPase)、phospholamban (SERCA 2的調控蛋白)以及鈣離子釋放通道 (Ca2+ release channel or ryanodine receptor)。根據學者們報告，敗血症時會發生這些酵素與接受器系統的損傷，使心肌細胞內鈣離子的分佈失恆(dyshomeostasis)，進而使心肌收縮力不足，最後導致心臟衰竭(heart failure)而造成死亡。既然這些酵素/接受器系統皆是蛋白激磷酸化的受質

，因而推測在敗血症時蛋白激的變化可能是造成心臟功能衰竭的重要因素。因此探討在敗血症造成心臟功能衰竭時之蛋白激A、C和M的活性與動力性質的變化情形，希望能瞭解蛋白激在敗血症病程變化中所扮演角色的重要性及與敗血症病程的相關性。 本實驗採用大白鼠盲腸結紮後並刺孔 (cecal ligation and puncture), 簡稱CLP手術，產生腹膜炎導致敗血症的發生。此動物模式可產生敗血症早期高血液動力狀態而晚期變成低血液動力狀態。CLP手術後9小時為早期敗血症組，CLP手術後18小時為晚期敗血症組。從細胞/細胞內的角度去探討不同敗血症時期造成心臟細胞功能損壞之機制中蛋白激

A、C和M的活性與動力性質的變化情形。實驗內容分成三個部分：第一部分為探討不同敗血症時期，心臟細胞中蛋白激A、C與M的活性變化與動力學 (Vmax：最大反應速率和Km：反應速率達到Ｖmax一半時之基質濃度)變化的特性。第二部分為深入探討不同敗血症時期大白鼠心臟分區，包括左、右心房、節律點以及左、右心室和室中隔中PKA的活性。希望能進一步瞭解PKA的活性是否有區域性的差異變化及其與敗血症時心臟功能損壞的相關性。第三部分為利用細胞膜箝制(patch clamp)技術，探討敗血症晚期時單一心臟細胞的電生理特性變化情形。因為蛋白激會影響多種離子通道，因此藉著瞭解敗血症晚期時，心肌細胞的膜電位(m

embrane potential)和鈣電流(Ca2+ current)的變化情形，將可以有更直接之証據去瞭解在敗血症時蛋白激的變化與心肌細胞離子通道的影響情況。 由探討蛋白激A、C與M的活性與動力學變化的特性之結果顯示 (1) 在敗血症早期，type I和type II PKA的活性均沒有受影響。在敗血症晚期，type I PKA的活性增加45 %，但是type II PKA的活性仍然不變。由動力學分析在敗血症晚期type I PKA對ATP、histone和cAMP之Vmax 值分別增加84.7、97.7和66.7%；可是對ATP、histone和cAMP之Km值卻

沒有改變。這些數據指出敗血症低動力晚期大白鼠心臟中type I PKA被活化。(2) 在敗血症早期，cPKC (細胞質部分PKC)的活性增加47 %，但是mPKC (與膜相關部分PKC)的活性沒有改變。在敗血症晚期，cPKC和mPKC的活性均沒有受影響。由動力學分析在敗血症早期cPKC對ATP、histone、Ca2+、 phosphatidylserine (PS)，和diacylglycerol (DG)之Vmax值分別增加73、53、54、38和48%，其相對之Km值沒有變化。這些數據指出敗血症高動力早期大白鼠心臟中cPKC被活化。(3) PKM的活性和其對ATP、casein、Ca2+

與calmodulin(CaM)的Vmax和Km的數值則均沒有改變。 心房與心室在解剖或生理功能上的表現皆有所不同。於敗血症心臟功能衰竭時，有文獻報告指出，對心臟中各個不同區域有不同的功能影響。這些現象加上本實驗結果顯示敗血症晚期大白鼠心臟中type I PKA活性上升且文獻報告PKA有細胞質與細胞膜之分隔區間(compartmentation)，因此深入探討不同敗血症時期大白鼠心臟分區中細胞質部分及與膜相關部分PKA的活性。結果顯示在生理狀態下，細胞質部分type I PKA的活性在心臟各分區呈現不均勻之分配 (左心房>右心房>節律點區>左心室>右心室>室中隔)，但是細胞

質部分type II PKA及與膜相關部分之type I和type II PKA的活性在心臟各分區則呈現較均勻之分配。早期敗血症，只在右心房和節律點區，細胞質部分type II PKA的活性分別增加32和70 %。晚期敗血症，只在室中隔之細胞質部分type I PKA的活性增加228 %以及與膜相關部份type I PKA的活性下降51.4%。這些結果顯示，在正常狀態或是敗血症演變過程中，對不同心臟區域，有著不同的PKA活性，其中影響最大的是室中隔區，由正常狀態下比其他區域低的細胞質部分type I PKA活性，演變到晚期敗血症時顯著上升的改變。 b-腎上腺素性興奮劑(ag

onist)，isoproterenol，作用在b-腎上腺素性接受器而增加L型鈣離子通道的打開頻率時，可增強L型鈣電流(Ica,L)。而b-腎上腺素性接受器可經由cAMP-依賴型磷酸化作用調控鈣離子通道。當敗血症時，鈣離子通道的失調將會影響心臟的幫浦功能。因此探討單一心臟細胞的電生理特性(膜電位和鈣電流)。結果顯示晚期敗血症組的心肌細胞靜止膜電位有顯著的比控制組者小。可是這兩組細胞的APD50和APD90 (動作電位的50 % 和90 % 再極化間期)卻沒有顯著差異。在電壓箝制實驗，b-腎上腺素性的興奮劑-isoproterenol (10 nM)，對由正常組和敗血症組大白鼠分離出來之心肌細胞

L-型鈣電流(ICa,L)之產生有相同的增加效應。但是卻不影響其對此兩組細胞ICa,L的不活化時間常數以及電流-電壓關係的整個曲線圖形。這些結果指出敗血症大白鼠心臟的b-腎上腺素性接受器仍然能作有效之反應且L型鈣離子通道還是維持有效的運作。 根據我們的實驗結果顯示在早期敗血症時，cPKC的活性被活化而type I 和type II PKA的活性均沒有改變。在晚期敗血症時，type I PKA的活性被活化，而cPKC 和m PKC的活性，則均沒有改變。在早期和晚期敗血症時，PKM的活性卻均沒有變化。綜合這些結果，在促進細胞內鈣離子交換週期的整個速率中，好像PKC扮演主要的角色

，而PKM和PKA則扮演次要的角色。因此PKC的被活化可能造成在敗血症早期時，增加心跳率和心肌收縮力的高動力狀態。 PKA在控制心跳起源之特化心房組織中的分佈是刺激心跳速率的關鍵，因此我們認為，當早期敗血症時，在右心房和節律點區被活化的細胞質部分type II PKA 造成心搏過快，而此作用將會導致敗血症早期的高動力狀態。由探討離體心室肌肉細胞電生理特性的結果顯示，敗血症晚期的大白鼠心臟對b-腎上腺素性的刺激仍然能作有效之反應。這些結果，加上在敗血症晚期type I PKA 被活化的現象以及文獻報告PKA的過磷酸化Ca2+釋放通道(ryanodine receptor)可造成病理性的增加肌漿網

中Ca2+的釋放，因此我們認為這持續增加的PKA活性有可能導致心肌細胞質內堆積過量的Ca2+濃度，反而壓制心肌收縮力，因而更造成敗血症晚期低動力時心臟功能的失調。由PKA活化的區域-特異性結果顯示室中隔區影響最大，由正常狀態下比其他區域低的type I PKA活性，演變到晚期敗血症時顯著上升的改變。因此我們認為敗血症時心臟功能異常，有可能是室中隔中PKA活性的改變而影響其功能表現，然後再導致整個心臟的病變。由對PKA、PKC和PKM 的動力學分析結果顯示PKA和PKC的Vmax值增加，但是Km值均沒有變化，這表示PKA或PKC本身的作用性質，在敗血症過程中並不受影響，而其活性的增加也不是作用在

受質或是基質的活化部位，因此PKA或PKC的活化過程並不是改變在轉譯後的修飾作用(post-translational modification)。 總而言之，本實驗證據顯示敗血症病理變化中，在室中隔之PKA活性的改變可能是造成敗血症進行時之心臟功能變化的原因。故蛋白激活性的改變，可能是導致敗血症時造成心臟功能衰竭的重要因素。而敗血症時之心臟功能異常，可能是先由室中隔中蛋白激的改變影響其功能運作再進而引起整個心臟出現衰竭現象。因為敗血性休克之預後很差，是否能夠及時給于早期治療是最大的扭轉關鍵。而本實驗結果也顯示，敗血症大白鼠心臟對b-腎上腺素性的刺激仍然能作有效之反應以

及L型鈣離子通道還是維持有效的運作。因此如果能在敗血症早期作局部控制一些蛋白激的活性與表現，或許將有助於病程的改善。