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生物轉換之新機能微生物的育種

為了解決醫強酒精4000ml的問題，作者陳錦惠 這樣論述：

本實驗利用細胞融合技術，以Schizosaccharomyces pombe 的原生質體為主體，分別與植物葉綠體或Monascus anka、Saccharomyces diastaticus、Zymomonas mobilis、Lentinus edodes等之原生質體間進行融合，或將所獲得的酵母融合株再次進行融合，以期能獲得新機能之酵母菌株。 由實驗結果所示，以含水量80%之麩皮與木屑比例為1:1.5的培養基，添加0.2~0.3%幾丁質粉末，培養Trichoderma viride 4天後，以90mL含0.6M KCl的50mM磷酸緩衝溶液(pH5.5)來萃取

出細胞壁分解酵素，在45C、50rpm振盪反應，可獲得M. anka、S. diastaticus、L. edodes之原生質體。但若要獲得Z. mobilis的原生質體則是添加300 µg/mL Lysozyme於含有0.8M sucrose為滲透壓穩定劑的細胞壁分解溶液中，在pH7.5、30C下靜置反應則可獲得。 在融合體形成最適條件方面：Schi. pombe原生質體與香菜葉綠體濃度皆為1×108cells/mL，並以1：1的比例混合後，添加適量的PEG溶液，靜置於30C、反應10min後，置於30C下厭氣包埋平板培養。 結果獲得15株融合

株(Fusant)，分別由Schi. pombe原生質體與榕樹、七里香、樟樹、香菜、薄荷、紫蘇等葉綠體融合獲得的Fusant 1、Fusant 2、Fusant 3、 Fusant 4、Fusant 9、Fusant 11、Fusant 12等，或與M. anka原生質體融合獲得Fusant 5、Fusant 6或與Fusant 2的原生質體再融合獲得Fusant 7，或與S. diastaticus的原生質體融合獲得Fusant 8，或與紅蘿蔔原生質體融合獲得Fusant 10，以及Saccharomyces cercvisiae 20581與Fusant 12的原生質體融合獲得Fusant

13，或 Z. mobilis與Fusant 12的原生質體融合獲得Fusant 14，或 Schi. pombe與L. edodes原生質體融合獲得Fusant 15。 在碳水化合物的利用性方面，各融合株均會利用glucose、fructose、cellobiose、maltose、potato starch、xylan、cellulose等碳水化合物，並且會發酵potato starch 及cellulose。在碳氫化合物的利用性及發酵性方面，融合株利用碳氫化合物的能力比親株更廣泛，但不具有如酵母的發酵性。 在最適生長條件方面：前培養時間10~15

小時，在30~37C， pH4~6，0.5~1% yeast extract並含有CaCl2.2H2O、CoCl2.6H2O等微量元素之2%~4%的馬鈴薯澱粉培養基中的生長情形最好。 在Fusant 5對碳水化合物之生物轉換方面： 將Fusant 5培養於potato starch之培養基中，可獲得1.7 % 酒精及0.28 % glycerol，0.86% arabitol；以cellulose為碳源時，可產生2% 酒精及0.95% acetate；以xylan為碳源時，可產生1.6 %酒精及1.1 % xylose；以glucose為碳源時，可產生0.25 % gly

cerol，6.3 % ethanol。親株Schi. pombe則可獲得0.26% glycerol及4.26 % ethanol。 在Fusant 11對碳氫化合物之生物轉換方面：以前培養時間為18小時、15%的接種量、氮源為yeast extract、培養溫度為30C 、pH5.5為p-cresol及benzylalcohol之最適生產條件。 在有機溶劑耐性方面：隨著有機溶劑濃度的增加，融合株的耐性越弱， Fusant 11可耐30% acetone。所有的融合株對ethanol的耐性最高只有10%，當濃度提高至20~30%時其生長則明顯的受到抑

制。所有的融合株皆可耐30% hexane，比在其他有機溶劑下具有較強的耐性。而Fusant 11對toluene的耐受性較強可耐至20%。在基質濃度對Fusant 11耐性及生物轉換之影響方面：提高glucose及potato starch濃度時融合株的耐性會跟著提高而且也會增加代謝產物的量。 綜合以上結果得知以細胞融合法所獲得之酵母融合株，其在形態及碳源利用性、發酵性及碳氫化合物利用性等方面均獲得比親株更多的新機能性，並且可利用高分子碳水化合物代謝出具有經濟價值的產物。一些石油中含有之碳氫化合物可能會有致癌性，故可將這些融合株應用於石油污染及含有有機溶劑之廢水處理或飲用

水之前處理等，另外融合株對有機溶劑具有耐性可使用於非水溶性原料之醫藥的合成、油及脂肪的修飾及多胜肽的合成，故以原生質體融合法可以有效的開發出新機能性的酵母。