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水禽類小病毒蛋白基因之分子選殖及抗原性分析

為了解決中興獸醫PTT的問題，作者朱純燕 這樣論述：

小病毒(parvovirus)在水禽類引起嚴重之病毒性腸炎，造成業者鉅大損失，為了有效防治小病毒感染而進行本實驗。由感染本病之水禽類檢體中，以聚合�窸s鎖反應增幅病毒核酸，並以限制酵素切割長度多形性分析，可快速診斷及鑑定鴨小病毒(duck parvovirus; DPV)和鵝小病毒(goose parvovirus; GPV)。為了分析10年來這些野外病毒的病毒外殼蛋白(viral capsid proteins; VPs)變異情形，進行VPs全長基因之定序分析，結果顯示在1990-1999年間所分離之各小病毒株間，其VPs胺基酸序列有4.1-4.4%之變異，其主要變異區集中在三種病毒蛋白的

共同區，位於203-266及482-534胺基酸序列間，這些區域與小病毒顆粒被預期暴露於最表面的區域相吻合，顯示宿主之免疫篩選為造成此變異之重要因素。在1999年分離的DPV及GPV間，其核酸序列有77%相似度，而其胺基酸序列則有84.6%之相似度，兩者間之最大變異區位在VP2之N端，於VP3轉譯起始點之前，有高達35% (19/54)之岐異度；此外，在DPV及GPV之VPs具有一些高度保守性之胺基酸位點，這些位點為病毒株特異性位點，在不同時期分離的同種病毒分離株之間很少有發生變異的現象，顯示這些胺基酸可能在維持病毒結構功能，或感染宿主之特異性上扮演重要角色，值得進一步研究。為了探討病毒蛋白之

抗原性，將GPV病毒蛋白共同區，以glutathione S-transferase (GST)融合蛋白形式大量表現GST-GPV (248-516胺基酸)，經純化後用以免疫兔子製備抗血清，並以西方墨點法檢測DPV和GPV純化病毒顆粒中之病毒蛋白，結果顯示，此抗血清可以偵測到兩種蛋白，其分子量分別為80及70 kDa，與其他文獻所報告之VP1及VP2之分子量相符合；此外，此抗血清對DPV的VP1之反應較弱，顯示此兩種病毒之封套蛋白有抗原性之差異性存在。另外，以細胞免疫化學染色法，可明顯區分未感染及感染小病毒之初代鴨胚纖維芽細胞，顯示此抗體可應用於病毒感染檢體之檢測。本研究嚐試以原核及真核系統大

量表現全長病毒蛋白，並評估其作為次單元疫苗之可行性，所使用之原核系統分別為GST融合蛋白及Histidine-tagged融合蛋白，而真核系統則分別為昆蟲桿狀病毒及哺乳動物vero細胞表現系統，所製備之重組病毒蛋白經純化後，以相同量分別免疫一週齡小鵝，並以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)，檢測免疫後抗體產生情形，結果顯示這四種重組蛋白免疫後四週，皆可有效提高ELISA抗體之力價於7-8倍，且經初步安全試驗證實這些重組蛋白具有製成次單元疫苗之潛力。