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國防醫學院 航太及海底醫學研究所 林石化所指導 丁宜瑄的 利用基因轉殖小鼠探討KLHL3 Kelch 結構域突變對假性醛固酮低下症 II 型 (PHAII) 之病生理角色 （2021），提出/bin/sh for loop關鍵因素是什麼，來自於假性醛固酮低下症 II 型 (PHAII)、Kelch-like 3 (KLHL3)、無意義突變(nonsense mutation)、非離氨酸激酶(WNKs)、鈉氯離子共同運輸通道(NCC)、鈉鉀氯離子共同運輸通道(NKCC2)、基因敲入(knock-in, KI)。
而第二篇論文東海大學 食品科學系 江文德所指導 許芸綺的 從豌豆蛋白水解物中分離及鑑定神經保護肽以對抗 β-類澱粉誘導損傷的SH-SY5Y細胞 （2020），提出因為有 豌豆蛋白、胜肽、神經保護作用、β-類澱粉、SH-SY5Y細胞、抗細胞凋亡的重點而找出了 /bin/sh for loop的解答。
利用基因轉殖小鼠探討KLHL3 Kelch 結構域突變對假性醛固酮低下症 II 型 (PHAII) 之病生理角色
為了解決/bin/sh for loop 的問題，作者丁宜瑄 這樣論述：
假性醛固酮低下症 II 型 (PHAII) 是一種遺傳性腎小管疾病，這些患者的特徵是具有鹽敏感性高血壓、低腎素活性、高血鉀以及代謝性酸中毒。Kelch-like 3 (KLHL3) 基因是假性醛固酮低下症 II 型患者中，最常見的遺傳性突變基因。儘管假性醛固酮低下症 II 型病人中，未發現NCC與NKCC2基因上有突變，但此類病人仍會表現NCC增強。目前文獻上表明了非離氨酸激酶【With-no-lysine [K] (WNK)】WNK1、WNK4、KLHL3以及Cullin3 (Cul3)，這四種基因突變皆可造成假性醛固酮低下症 II 型。雖然Kelch結構域的錯義突變(missense m
utation)，其功能性角色曾被探討過，但同一結構域中的無意義 KLHL3 突變點(nonsense mutation)對假性醛固酮低下症 II 型的病生角色，目前在體內尚未有完整的研究。此外，先前研究也證實了WNKs會磷酸化下游Ste20相關的脯氨酸/富含丙氨酸激酶(Ste20-related proline/alanine-rich kinase，SPAK)和氧化壓力反應激酶1(oxidative stress response kinase 1，OSR1)，進而刺激NCC和NKCC2 【WNK1/WNK4-SPAK/OSR1-NCC/NKCC2級聯】，這種磷酸化活化級聯反應(WNK1/
WNK4-SPAK/OSR1-NCC/NKCC2級聯)被認為是假性醛固酮低下症 II 型的主要發病機制，此外，由於KLHL和 Cul3會形成Cullin-RING E3 泛素連接酶複合物（E3 複合物）的一部分並且會共同作用以降解 WNKs，因此KLHL3 突變會減少WNK1 和WNK4的降解，而使它們蛋白質表現增加。 本研究製造並分析攜帶無義KLHL3 W523X 突變點的基因敲入(knock-in, KI)小鼠（相當於人類 KLHL3 W470X 突變點）。雜合子(Heterogeneous，He )和純合子( Homogeneous，Ho ) KLHL3W523X/+ KI 小鼠都表現出
典型的假性醛固酮低下症 II 型，並伴有低腎素性高血壓、高鉀血症同時腎鉀排泄減少和高氯代謝性酸中毒。它們的腎臟組織顯示KLHL3 mRNA存在、KLHL3 蛋白質增加表現，以及下游 WNK1/WNK4-SPAK/OSR1-NCC/NKCC2 磷酸化增強。體外研究則表明，人類 KLHL3 W470X 突變點有助於形成更穩定的KLHL3 蛋白質，進而破壞與 WNK1和WNK4 的結合，最終導致WNKs降解減少、WNK1和WNK4蛋白質增加。總結，無意義 KLHL3W523X/+ 突變基因敲入小鼠表現出典型的假性醛固酮低下症 II 型表現型。這是由於穩定但功能缺陷的KLHL3蛋白，會導致與 WNK1
和WNK4 結合力受損，而增強腎臟組織中上游NCC與NKCC2表現。 由於減少了與 WNK1 和 WNK4 的結合能力，無意義的KLHL3突變在 PHAII中發揮了致病作用。
從豌豆蛋白水解物中分離及鑑定神經保護肽以對抗 β-類澱粉誘導損傷的SH-SY5Y細胞
為了解決/bin/sh for loop 的問題，作者許芸綺 這樣論述：
本研究首先利用β-類澱粉 (Beta-amyloid, Aβ) 誘導人類神經母細胞瘤 (SH-SY5Y) 細胞損傷後，探討三種水解物包括Flavourzyme分別水解豌豆蛋白Y及H 6 h 所得之FPPH-Y-6h及FPPH-H-6h，以及Flavourzyme水解分離大豆蛋白T 8 h所得之FISPH-T-8h的預處理對其保護神經細胞之作用。結果顯示經FPPH-Y-6h預處理組具有最高之保護作用，其細胞存活率顯著從誘導組的59.6 % 提升至81.7 %。其次，探討高效液相層析依序配合凝膠管柱 (GF)、逆相層析管柱 (RP) 及陽離子交換管柱 (CE) 進行區分，對神經保護作用提升之影響
，結果指出FPPH-Y-6h 經 GF、RP 及 CE 區分所獲得區分物中，CE-2具有最佳的神經保護作用，經CE-2預處理的損傷SH-SY5Y細胞其存活率顯著從50.8 % 提升至93.5 % (p < 0.05)。最後，CE-2經LC-MS/MS鑑定所得之胜肽片段包括 NF、GF及 RP，其中以1 ppm GF預處理組具有最佳之保護作用，可顯著提升粒線體膜電位及降低胞內活性氧含量，此外經模擬胃腸道消化試驗其保護作用不受影響。後續探討FPPH-Y-6h 及GF神經保護機制，藉由活化Akt/Nrf2路徑，提升p-Akt表現量，進而促進抗氧化酵素 (HO-1、SOD、CAT、GPx) 活性去對抗
氧化傷害;而Akt/GSK-3β路徑上，p-Akt會磷酸化GSK-3β，以降低下游tau蛋白過度磷酸化，減少神經纖維纏結；於Aβ誘導造成粒線體凋亡路徑上，可顯著提升抗凋亡蛋白Bcl-2，降低促凋亡蛋白Bax及Caspase-3之蛋白質表現量，因此FPPH-Y-6h 及其合成胜肽均具有開發為神經保護相關產品應用於機能性食品中。